李颖-蜂毒注射液对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡影响的研讨

摘要

意图:探求蜂毒注射液对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(FLS-RA)凋亡的影响。

办法:原代培育狄普台风FLS-RA,MTT法测定蜂毒注射液对细胞增殖及细胞毒性效果,hoechst染色法调查凋亡小体,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率。

成果:安排块培育法培育2周后细胞向心性摆放,呈梭形及三角形。经过3~5次传代,FLS-RA细胞逐步纯化,以FLS为主(>95%),体外成长安稳。倒置相差显微镜调查细胞形状:细胞摆放规整,向心性摆放,呈梭形或三角形,偶见圆形细胞,细胞核成卵圆形,居细胞中心,胞质均匀透亮。

干涉24h:各组生存率低于空白对照组(P<0.05),浓度越高,生存率越低;

蜂毒注射液处理48h:各组生存率低于空白对照组(P<0.05),浓度越高,生存率越低;同浓度蜂毒注射液处理24h生存率与48h

比较:48h组小于24h组(P<0.05)。运用ORIGIN 5.0软件核算蜂毒注射液的对折按捺浓度(IC50)为(16.790.13)mg/L。

试验组与阳性李颖-蜂毒注射液对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡影响的研讨对照组中凋亡小体形状类似,细胞核呈细密浓染,色彩发白,而阴性对照组未见显着凋亡小体,细胞核未见固缩的染色质。B1区为细胞碎片,B2区为晚期凋亡和逝世的细胞,B3区为正常细胞, B4区为前期凋亡的细胞。因为B2区包括逝世的细胞,多挑选B4区比较前期凋亡率。低浓度组蜂毒注射液效果FLS-RA细胞24h,前期凋亡率大于空白对照组(P<0.05);高浓度组蜂毒注射液前期凋亡率显着高于空白对照组(P<0.01),且大于低浓度组(P<0.05)。

定论:蜂毒注射液可诱导成纤维样滑膜细胞凋亡,这可能是蜂毒医治类风湿关节炎的机理之一。

关键词

类风湿关节炎(RA);蜂毒注射液;成纤维样滑膜细胞(FLS-RA);细胞凋亡

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以对称性多关节胀痛为首要临床体现的一种体系性本身免疫性疾病,以关节滑膜缓慢炎症、关节进行性损坏、关节变形及功用损失为首要病理体现。临床体现为对称性多关节肿胀 、痛苦 、晨僵以及全身多体系的劳累,此病病因未明 ,具有发病率高 、致残率高的特色, 严重影响了患者的劳动力及日子质量 [1~2]。蜂毒对类风湿关节炎患者具有较好的效果,但蜂毒经过何种机制起效果很少有人探求,国内外研讨发现成纤维样滑膜细胞(FLS-RA)增生特色类似于肿瘤细胞增生特色,蜂毒可经过多条途径诱导肿瘤细胞凋亡,故规划本试验探求蜂毒对FLS-RA凋亡的影响。

一、资料与办法

1.标本选材

4例类风湿关节炎滑膜标本均取自深圳市第六人民医院骨科行关节置换或关节镜手术患者,一切RA患者确诊均契合2009年ACR/EULA拟定的RA分类规范和评分体系,得分均>6分。

2.仪器和试剂

恒温CO2细胞培育箱 、流式细胞仪(美国beckman coulter公司)、蜂毒注射液(长春博奥生物有限公司)、胎牛血清(美国Sigma公司)、DMEM/F12细胞培育基(Hyclone公司)、MTT试剂盒(碧云天公司)、hoechst试剂盒(碧云天公司)、Annexin V/PI试剂盒(invitrogen公司)、细胞凋亡阳性对照试剂盒(碧云天公司)。

3.成纤维样滑膜细胞的别离培育

将术后RA滑膜安排放入盛有DMEM/F12培育基的15mL离心管内低温保存,除掉附着的脂肪安排及血块,用预冷PBS液冲刷3次,将安排块修剪成1mm1mm1mm的小块,放置于培育瓶中,参加DMEM/F12彻底培育基,放置于细胞培育箱细胞培育箱内培育,每3天替换培育基,调查滑膜细胞成长状况,待成纤维样滑膜细胞长满至掩盖瓶底细胞>80%,进行传代,一般选用一传二。将3~5代的细胞在倒置光学显微镜下进行判定及试验。

4.MTT检测试验

蜂毒浓度装备参照临床蜂毒注射液浓度稀释于DMEM/F12彻底培育基中。取96孔细胞培育板,设置空白对照组、低浓度组(0.1mg/L,0.5mg/L,1mg/L)、中浓度组(2mg/L,4mg/L,8mg/L)、高浓度组(16mg/L,20mg/L,25mg/L),每个浓度设置3个复孔,首要参加100L细胞混悬液(FLS-RA 细胞数5104/mL),细胞培育箱培育24h,吸除培育基,参加100L上述浓度装备的蜂毒注射液培育基,细胞培育箱培育24h,参加100L MTT液,培育箱孵李颖-蜂毒注射液对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡影响的研讨育4h,再参加100L甲瓒溶解液,培育箱孵育4h后,在酶标仪下选用570mm波长测定吸光度。

5.hoechst染色法调查凋亡小体

试验设置阴性对照组 、试验组(依据MTT试验的对折按捺浓度确认蜂毒注射液浓度16mg/L)、阳性对照组。将盖玻片放置于6孔板中, 每孔参加2mL细胞混悬液(FLS-RA细胞数1104/mL),显微镜下调查细胞爬片成功后,别离参加彻底培育基、16mg/L蜂毒注射液培育基、细胞凋亡诱导试剂A+B,放入培育箱孵育24h,吸除玻片外表培育基,参加0.5 mL固定液,室温固定10min,无菌PBS冲刷2次,滴入适量Hoechst染色液染色9min,无菌PBS冲刷2次,封片液封片, 倒置荧光显微镜下调查细胞形状。

6.Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率

依据MTT试验成果挑选最佳浓度,设置低浓度组 (4mg/L)李颖-蜂毒注射液对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡影响的研讨,高浓度组 (16mg/L),空白对照组(彻底培育基)。6孔培育板每孔参加1mL细胞重悬液(FLS-RA细胞数5104个/mL)中。依照试验规划顺次参加蜂毒注射液培育基混悬液,孵育24h,无菌PBS冲刷两次,胰酶消化后转移至流式管中,离李颖-蜂毒注射液对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡影响的研讨心去上清,无菌PBS冲刷1次,参加1AnnexinV重悬,将重悬液稀释至1106/mL,各组取100L至流式管中,一起参加5L Alexa Fluor 488Annexin V和1L 100 g/mL PI工作液, 室温孵育15min,离心去上清后,参加1XAnnexin V定容至500L,细胞滤网过滤, 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡状况。

7.统计学办法

一切试验数据均运用 (xs) 标明,运用SPSS19.0体系进行统计学剖析, 一切数据都选用正态 、方差剖析,若不满意,用秩和查验。

二、试验成果

1.FLS原代培育及判定安排块培育法培育

2周后细胞向心性摆放,呈梭形及三角形 。经过3~5次传代,FLS-RA细胞逐步纯化,以FLS为主(>95%),体外成长安稳。倒置相差显微镜调查细胞形状:细胞摆放规整,向心性摆放,呈梭形或三角形,偶见圆形细胞,细胞核成卵圆形,居细胞中心,胞质均匀透亮。

2.各组OD值比较

干涉24h:各组生存率低于空白对照组(P<0.05), 浓度越高,生存率越低;

蜂毒注射液处理48h:各组生存率低于空白对照组(P<0.05),浓度越高,生存率越低;

同浓度蜂毒注射液处理24h生存率与48h比较:48h组小于24h组(P<0.05)。运用ORIGIN 5.0软件核算蜂毒注射液的对折按捺浓度(IC50)为(16.790.13)mg/L。

3.hoechst染色调查凋亡小体

见图1。试验组与阳性对照组中凋亡小体形状类似,细胞核呈细密浓染,色彩发白,而阴性对照组未见显着凋亡小体,细胞核未见固缩的染色质。

4.各组细胞凋亡率比较

见图2。B1区为细胞碎片,B2区为晚期凋亡和逝世的细胞,B3区为正常细胞,B4区为前期凋亡的细胞。因为B2区包括逝世的细胞,多挑选B4区比较前期凋亡率。低浓度组蜂毒注射液效果FLS-RA细胞24h,前期凋亡率大于空白对照组(P<0.05);高浓度组蜂毒注射液前期凋亡率显着高于空白对照组(P<0.01),且大于低浓度组组(P<0.05)。

三、评论

RA是以对称性多关节危害的一种本身免疫性疾病,其病理体现为滑膜安排反常增生。滑膜安排是包裹在关节外面的一层膜安排,正常的滑膜安排在解剖学上可分为两个部分:滑膜内层(面料层)和滑膜基层(面料基层),滑膜内层介于滑膜基层与滑液之间,这层有两种首要类型的细胞:巨噬样细胞(又称A 型滑膜细胞)和成纤维样细胞(又称B型滑膜细胞)[3~4]。很多的研讨证明,FLS-RA具有超凡的增殖才能以及高强度的腐蚀力,面料层的滑膜细胞反常增生可能与细胞凋亡遭到不同程度的按捺相关[5~6]。

蜂毒是饱尝长时期检测的天然药物,在风湿病的医治中占有重要位置[7]。药理研讨标明,蜂毒具有镇痛、抗炎、降血压、抗凝血、抗菌、防辐射、抗肿瘤等效果。近年来用于医治本身免疫性疾病、神经体系疾病、运动体系疾病、心血管疾病、变态反响性疾病等。临床试验研讨标明,蜂毒有抗炎、调理免疫效果,可改进类风湿因子、血沉、C-反响蛋白、抗环瓜氨酸抗体等目标[8~11]。体外研讨及动物试验发现,蜂毒能够有用按捺大鼠体内多种细胞因子的水平,这对按捺滑膜安排炎症和阻断关节软骨基质的降解有正面效果, 从而起到维护关节软骨的效果[12~14]。

本试验经过蜂毒注射液效果于体外原代培育的FLS,MTT试验显现在必定范围内[(0.1~25)mg/L]跟着蜂毒注射液浓度升高,FLS的的生存率逐步下降,经过hoechst染色法可调查到凋亡小体,运用AnnexinV/PI双染法联合流式细胞术检测发现蜂毒注射液诱导FLS-RA凋亡,且高剂量组的前期凋亡率大于低剂量组以及阴性对照组。有动物试验研讨发现,蜂毒肽是蜂毒医治RA的活性成分[15],是否蜂毒经过蜂毒肽而诱导FLS的凋亡有待进一步探求。

业务联系

转载:天之力医药

作者:谭宁1,王科澎2,贺守第3,

罗晓光1,朱辉军1,黄胜光1

1. 广东医学院隶属深圳南山医院中医风湿科

2. 深圳市福田区中医院

3. 湖南中医药大学

通讯作者:黄胜光

E-mail:282111306@qq.com

本论文刊载于:新中医

2015年6月第47卷第6期